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立克次氏体(Rickettsia)为革兰氏阴性菌，是一类专性寄生于真核细胞内的G-原核生物。是介于细菌与病毒之间，而接近于细菌的一类原核生物。一般呈球状或杆状，是专性细胞内寄生物，主要寄生于节肢动物，有的会通过蚤、虱、蜱、螨传入人体、如斑疹伤寒、战壕热。因此对立克次氏体进行快速灵敏的诊断具有重要的意义。

1. 即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
   
2. 引物经过优化，灵敏性高，分析灵敏度可以达到100拷贝/反应。
   
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
   
4. 特异性高，引物是根据立克次氏体高度保守区设计，不会跟其他生物的DNA发生交叉反应。
   
5. 本制品足够50次20μL体系的染料法荧光定量PCR反应。
   
6. 既可用于定性，也可用于定量。用于定量时线性范围至少5个数量级。
   
7. 本制品只能用于科研。

1. 标记6个离心管，分别为6、5、4、3、2、1。
   
2. 用带芯枪头分别加入45μL荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同)。
   
3. 在6号管中加入5μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
   
4. 换枪头，在5号管中加入5μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
   
5. 换枪头，在4号管中加入5μL 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁴拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
   
6. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

7. 如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC(样品制备阳性对照)，一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL第6步所得的第4号稀释液(1×10⁴拷贝/μL)再加上一定量的水使总体积跟核酸纯化试剂盒所要求的起始样本体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。
   
8. 用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容，也可使用本公司的免提取核酸释放剂。

9. 如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
   
10. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：
    

    成分	样品管 N+2个	PCR阴性 对照管	标准曲线 样品管(1～6管)
    2×SYBR qPCR MasterMix	10μL	10μL	各10μL
    立克次氏体染料法qPCR引物混合液	2μL	2μL	各2μL
    N+2个待测DNA模板	8μL	不加	不加
    超纯水	不加	8μL	不加
    第6步所得标准曲线样品稀释液(1～6号)	不加	不加	各8μL

11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
    

    过程	温度	时间
    预变性	95℃	5分钟
    PCR反应 (35个循环)	95℃	10秒
    	60℃	40秒(采集SYBR通道的荧光信号)
    溶解曲线分析	按qPCR仪器手册执行

    注意：循环次数不要超过35个循环。

12. 通过溶解曲线分析的结果排除无效数据。有Ct值，但Tm值跟阳性对照Tm不一样的样品(包括对照和待测样品)，归为假阳性，数据无效，不予以分析。Tm跟阳性对照Tm一致的，为有效Ct。
    
13. 如果两种阴性对照的溶解曲线所得Tm值跟阳性对照的Tm值一样，说明环境或试剂可能有过去的PCR扩增产物污染，则此次实验无效，需要解决污染问题再进行实验。
    
14. 如果两种阴性对照(样品制备阴性对照和PCR阴性对照)是假阳性，可以继续分析其它样品有效数据。
    
15. 对定量检测，以阳性对照样品的浓度的log值为横轴，以有效Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的有效Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再换算出待测样品的DNA浓度。
    
16. 对定性检测，则有有效Ct值的为阳性，无有效Ct值的为阴性。